Биолог Константин Лукьянов о применении флуоресцентных белков, типах фотоактивации и ограничениях световой микроскопии
Как были найдены первые флуоресцентные белки? Какие существуют разновидности фотоактивации таких белков? Какие задачи в молекулярной биологии решаются с их помощью? Об этом рассказывает доктор биологических наук Константин Лукьянов.
Прежде чем говорить о фотоактивируемых флуоресцентных белках, следует сказать несколько слов о том, что такое флуоресцентные белки как таковые, откуда они взялись и зачем они нужны. Первый флуоресцентный белок был найден в морской медузе Aequorea victoria почти 50 лет назад, в 60-х годах. Но в первые 30 лет к этому белку не было особого интереса, пока ученые не нашли соответствующий ген, не клонировали и не поняли, что это совершенно уникальный, удивительный тип белковых молекул.
Дело в том, что в природе существует множество пигментов, как флуоресцентных, так и нефлуоресцентных, многие организмы ярко окрашены. Но во всех этих случаях белковая часть пигмента не поглощает свет. Как известно, белки поглощают только ультрафиолетовые области света и не могут быть видимы глазу. Для пигментов обязательно нужна небелковая часть, которая синтезируется в результате сложного каскада ферментативных реакций, включающих 5–10, а иногда и больше ферментов. Поэтому использовать такие каскады на практике, когда вы хотите окрасить какой-то модельный организм, практически невозможно. Флуоресцентные белки представляют собой совершенно другой тип белковой укладки, семейства. В данном случае хромофор образуется самопроизвольно, путем посттрансляционных модификаций внутренних аминокислот. Таким образом, один белок без участия помощников (других белков и кофакторов из внешней среды) самостоятельно становится флуоресцентным. Это открыло совершенно потрясающие, фантастические возможности мечения живых организмов путем внесения в них одного-единственного гена — гена флуоресцентного белка.
Первый белок был назван green fluorescent protein (GFP). И с тех пор название GFP, GFP-подобные белки, закрепилось в научной и ненаучной литературе. Флуоресцентные белки позже были найдены во многих морских организмах. Это и коралловые полипы — все мы знаем цветовое разнообразие кораллов, некоторые ныряли, некоторые просто видели какие-то фильмы, и вот почти все разнообразие цветов коралловых полипов объясняется присутствием флуоресцентных или окрашенных белков из этого семейства. Некоторые морские рачки окрашены GFP, и даже некоторые низшие хордовые ланцетники несут GFP.
Из всего этого разнообразия был создан прекрасный набор инструментов для молекулярных клеточных биологов, который позволяет отслеживать целевые молекулы или целевые клетки в модельных организмах, которые могут быть помечены генетически. То есть вы должны иметь возможность внести ген флуоресцентного белка в организм и затем следить за клетками или внутри клеток за белками, за тем, как они функционируют. Важно, что в данном случае мы имеем дело с живыми организмами, с живыми клетками, а не с фиксированными препаратами, как было ранее при использовании химических красителей. Обычные флуоресцентные белки позволяют увидеть, где, в какой части клетки находится целевой белок. Но сложно увидеть его динамику: как быстро он двигается, с какой скоростью он синтезируется или, наоборот, распадается. Здесь на помощь приходят фотоактивируемые белки.
Что такое фотоактивация? Это когда флуоресцентный белок способен многократно, очень сильно, иногда в сто-тысячу раз увеличить свою флуоресценцию в ответ на облучение светом определенной длины волны. И такое оптическое мечение создает уникальные возможности не просто видеть флуоресцентный белок, но и в нужном месте в нужное время зажечь флуоресценцию и дальше за ней следить.
Какие на сегодняшний день сделаны фотоактивируемые флуоресцентные белки? Есть два основных типа фотоактивации: обратимая и необратимая. В случае необратимой фотоактивации флуоресцентный белок зажигается светом один раз. В данном случае происходит химическая реакция, которая приводит к изменению флуоресцентного белка и переводу его из одного спектрального состояния в другое. Например, есть первый фотоактивируемый флуоресцентный белок, который был описан в начале 2000-х годов, photoactivatable green fluorescent protein (PA-GFP). Этот белок переводится из темнового, невидимого состояния в ярко-зеленое облучением фиолетовым светом. При этом происходит декарбоксилирование одного из остатков глутамата внутри белка и выделение молекулы CO2. Естественно, такая фотоконверсия является необратимой, поскольку молекула CO2 улетает. И белок переходит в ярко-зеленое состояние. Другой очень распространенный и полезный тип фотоактивации — это перевод белков из зеленого в красное флуоресцентное состояние. Первый такой белок был описан японскими учеными в 2003 году и получил название Kaede. С японского это переводится как «кленовый лист». Соответственно, таким способом был подчеркнут переход из зеленого в красное состояние. В данном случае происходит разрыв белковой цепи около хромофорной группы, что также является необратимым событием.
Как использовать фотоактивируемые белки? Самый простой способ — вы можете следить за перемещением целевого белка в клетке.
Интересной группой фотоактивируемых флуоресцентных белков являются обратимо фотоконвертируемые белки. В таких случаях вы можете много раз производить фотоконверсию из одного состояния в другое и обратно. Соответственно, это связано не с фотохимическими реакциями, а скорее с изомеризацией хромофора и его протонированием или депротонированием. Такие реакции являются хорошо обратимыми и могут быть повторены сто и более раз. Первым таким белком стал так называемый kindling fluorescent protein (KFP), который описали в нашей лаборатории в 2003 году. Он способен активироваться из темнового состояния, невидимого, в красное флуоресцентное состояние путем воздействия зеленого света. Если вы посветите на белок синим светом или просто оставите его в покое, он возвращается обратно в темновое состояние. Это можно производить много раз. Замечательный и очень удобный белок был описан вскоре после этого японскими учеными, он получил название Dronpa. Здесь происходил аналогичный переход, только из темного в зеленое флуоресцентное состояние и обратно.
Как использовать фотоактивируемые белки? Самый простой способ — вы можете следить за перемещением целевого белка в клетке. Или за целевой клеткой в составе организма. Каким образом? Вы освещаете небольшой участок светом, который фотоактивирует флуоресцентный белок. Далее в этом месте появляется флуоресцентный сигнал и мигрирует в другие части клетки. Таким образом, вы, наблюдая за флуоресцентным сигналом, напрямую видите, с какой скоростью и куда передвигается меченый белок. Можно также следить за миграцией клеток в составе многоклеточных организмов. Например, как в процессе развития мигрируют клетки в зародыше.
Следующим направлением в использовании стало слежение за деградацией белков. Дело в том, что в случае с флуоресцентными белками можно увидеть только стационарный уровень белка в клетке. С одной стороны, он постоянно синтезируется, а с другой — деградирует. И чтобы увидеть его деградацию, то есть измерить скорость этой деградации, нужно каким-то образом остановить синтез. Это можно делать с помощью блокаторов синтеза, но это очень мощное влияние на клетку, которое вообще меняет всю ее физиологию. И здесь тоже помогает фотоактивация. После фотоактивации фотоактивируемого флуоресцентного белка в клетке новый сигнал, который не был ранее виден, становится независим от синтеза. Например, если вы перевели флуоресцентный белок из зеленого в красное состояние, весь вновь синтезируемый белок получается зеленым. А то, что вы фотоактивировали, является красным, и по его распаду вы можете судить о деградации целевого белка.
Совсем неожиданная область применения этих белков возникла относительно недавно, когда оказалось, что они могут быть использованы для флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения. Еще более ста лет назад был сформулирован закон, согласно которому разрешение оптической микроскопии не может быть выше определенного порога, который называется дифракционным пределом световой микроскопии и равен примерно половине длины волны возбуждающего света. Если у вас длина волны света 500 нанометров (это зеленый свет), значит, вы получаете разрешение не выше 250 нанометров. Многие элементы клетки по размерам гораздо меньше, чем 250 нанометров, и биологам, конечно, хотелось бы их видеть. И на помощь тут приходила электронная микроскопия и другие типы высокоразрешающей микроскопии, но они недоступны для использования на живых организмах, на живых клетках. В 2006 году была проделана работа, результаты которой были опубликованы в журнале Science. Она показала, что фотоактивируемые белки могут быть использованы для преодоления дифракционного барьера разрешения световой микроскопии. В данном случае наблюдались отдельные молекулы флуоресцентных белков, которые получались после фотоактивации. Когда вы наблюдаете одну-единственную молекулу, то пятно от нее получается большое, те самые 200–250 нанометров, но, поскольку вы знаете, что это одна молекула, вы можете математически в центр поставить маленькую точку, которая покажет, где именно она находится. Это можно сделать с гораздо большим разрешением, порядка 10–20 нанометров. Если вы пронаблюдаете множество таких белков, например миллион, и поставите для каждого из них точку, то из этих точек, подобно картинам пуантилистов, можно увидеть картину распределения белка в клетке с очень высоким разрешением. Этот метод в последние годы очень активно развивается, и если в первой работе на съемку одного-единственного кадра уходили примерно сутки — естественно, это были фиксированные клетки, но все равно это было очень долго и трудно, — то сейчас на получение такого изображения тратится несколько секунд, и это можно делать даже на живых клетках.
Несмотря на довольно хорошее развитие этой технологии, остаются моменты, которые хочется улучшить и развить. Пока не хватает фотоактивируемых флуоресцентных белков в красной и особенно в дальнекрасной области спектра. В данной области меньше автофлуоресценции клеток, и поэтому они особенно удобны в использовании. И до сих пор в микроскопии сверхвысокого разрешения основным недостатком фотоактивируемых флуоресцентных белков является их низкая фотостабильность. Удается получить только малое количество фотонов с каждой молекулы, что затрудняет реконструкцию картинки. Получение очень высокостабильных, высокофотостабильных фотоактивируемых флуоресцентных белков представляется крайне актуальной задачей.
Константин Лукьянов
доктор биологических наук, заведующий лаборатории биофотоники Института биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН